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        表观组-全基因组Bisulfite甲基化测序(WGBS)

        全基因组甲基化测序(WGBS)介绍

        全基因组甲基化测序(WGBS,Whole-genome bisulfite sequencing)结合了亚硫酸氢盐转化方法与新一代高通量测序技术,可在单碱基分辨率水平上高效地检测全基因组DNA甲基化状态。亚硫酸氢盐处理可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。对 PCR产物进行高通量测序,与参考序列比对,即可判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化。

         

        伯豪特色

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        实验流程 


        分析流程


         

        推荐测序模式

        1. Hiseq X Ten, PE150
        2. 至少30 X基因组大小

        分析内容

        测序数据质量控制
        包括:总reads数、总base数,Q20比例、Q20位点分布图、碱基分布图。
        测序数据预处理
        包括:去除总体质量偏低的reads,将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除;去除3’端质量Q低于20的碱基;去除reads中所含有的接头序列;去除长度小于20的测序片段(reads),去除含有低质量N碱基的reads。
        转化效率评估
        使用lamda噬菌体基因组作为内参,评价BS转化效率。
        全基因组比对和mapping率统计。
        CpG岛区域、启动子区域及整个基因组的覆盖及不同深度关系。
        CpG/CHG/CHH位点覆盖率、测序深度、甲基化比例和染色体分布。
        差异甲基化位点和区段筛选。
        基因promoter、TSS、gene body区域甲基化水平计算和筛选。
        差异甲基化位点或区段的CpG岛注释和基因注释。
        全基因组甲基化图谱。


        结果展示



        样本要求

        1. 样品纯度:OD 260/280值应在1.8~2.0 之间; RNA 应去除干净;
        2. 样品浓度:低浓度不低于50ng/μl;
        3. 样品总量:每个样品总量不少于2μg;
        4. 样品溶剂:应溶解在H20或TE (pH 8.0)中;
        5. 样品运输:DNA低温运输(-20℃);在运输过程中用parafilm将管口密封好,以防出现污染。

         

        常见问题

        1.哪些物种可以研究WGBS?

        要做全基因组甲基化分析,对物种有以下要求:
        a. 物种为真核生物;
        b. 物种具有参考基因组,至少拼接到scaffold水平;
        c. 具有较为完整的注释。

         

        2.全基因组甲基化测序有哪些优势?

        在全基因组水平,单碱基分辨率检出甲基化位点,不仅能够高精度发现CpG岛等常见区域的甲基化水平的变化,还能够分析gene body区,基因间区等区域的甲基化水平的差异,分析甲基化对染色体的状态以及基因结构变化的影响,从多维度分析解决生物学问题。

         

        3.为什么WGBS所得的raw data产量和Q30比例较全基因组重测序的低?

        因为在WGBS建库过程中,非甲基化的C会转化为U(测序过程中呈现为T),因此WGBS文库处于碱基极度不平衡的状态(read1中C含量极低、read2中G含量极低)。而Illumina测序仪在cluster定位过程中会过滤较高比例的cluster,使得raw data产量降低;另外由于GC含量较极端,测序过程中质量值也较容易下降。

         

        案例展示

        人类早期胚胎DNA甲基化图谱

        在哺乳动物胚胎的早期发育中,甲基化是表观调节的重要内容。但是,在人类全基因组范围内,胚胎的早期甲基化动态调节模式由于技术的困难和材料的缺乏并没有充分的研究分析。本研究中,通过全基因组的亚硫酸氢盐测序技术,系统的描绘了从受精卵到胚胎植入后甲基化的变化。研究发现,在2细胞时期全基因组发生了去甲基化波动。这与之前在小鼠中的研究结果相反。而且,来自父本染色体上的基因去甲基化显著快于母本,到受精卵时期结束的时候父本的前核甲基化状态已经低于母本的前核。在早期胚胎发育的过程中,启动子区甲基化与基因表达的负相关性逐渐加强,在胚胎移植后到达峰值。此外,本研究还指出活跃的基因在胚胎移植前的整个过程都没有被甲基化。早期胚胎往往保持更高的甲基化残留,在转座子进化上更活跃。这些研究对于研究人类早期胚胎的甲基化提供了新的视角。