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        Milliplex样本收集指导

        所有样本建议分装冻存,避免反复(>2)冻融,储存时间超过1年的样本需要评估
        1.血清样本的制备
        ?采集血液样本,将其置于不含抗凝剂的试管内至少30min
        ?以1000g离心10min,仔细收集血清
        ?将血清置于标记有日期、采集时间、和病历号的试管内
        ?立即操作、合理冷藏或冷冻样品
        ?当天收集的血清如果当天需要测试,需要保存在4℃中,如果隔天测试,或者更久,则需要分装后保存在-80℃。

        2.血浆样本的制备
        ?采集血液样本,置于含有适量抗凝剂的试管内
        ?室温静止30min
        ?以1000g离心10min(血样采集后30min之内进行)
        ?将血浆置于标记有日期、采集时间、动物名称和病历号的试管内
        ?立即操作、冷藏或冷冻样品
        注:避免唾液污染,不要使用肝素或柠檬酸钠抗凝

        ? 唾液污染:唾液可能含有高丰度的某些心血管相关标志物 ( MPO, SAA, and Lipocalin-2/NGAL),导致结果不准确。
        ? 肝素(heparin)或柠檬酸钠抗凝抗凝:可导致Troponin-I 和 troponin-T 偏低(吸附导致)VEGF, MCP-1, eotaxin, factor VII偏高等



        3.细胞培养上清样本处理
        ?3000g x离心10分钟,收集上清
        ?若样本需要稀释,请准备稀释液
        ?分装冻存≤-20°C 或者≤-70° C


        注意事项:
        ?建议培养细胞时准备复孔(避免边缘效应)。
        ?血清中含有某些细胞因子,建议使用无血清或低血清条件培养基。
        ?不同细胞可根据生长状况确定培养时间。


        4.尿液样本处理
        ?日间取尿液至无菌容器中。
        ?10000g,离心5分钟。
        取上清分装冻存(无须防腐剂)。


        注意事项
        ? 分装冻存,避免反复冻融。
        ? 收样后及时处理保存
        ? 根据需要取晨起的中段尿.


        5. 房水样本处理
        ? 前房穿刺取样(paracentesis of the anterior chamber)。
        ? 转移至冰上无菌EP管中。
        ? 16000g,4度离心5分钟(目的是去除除细胞杂质)
        ? 取上清分装冻存。 


        注意事项
        ? 尽量在4冰上及4度环境中处理样本。
        ? 分装冻存,避免反复冻融。


        6. 痰液样本处理
        ? 漱口及取痰液至50ml无菌离心管中。
        ? 4度保存并于2小时内处理。
        ? 称重并加4倍体积的0.1%二硫苏糖醇(PBS或生理盐水等)并混匀。
        ? 37°C震荡孵育15分钟(每5分钟移液器吹打混匀)。
        ? 48μm的尼龙网过滤后790g,室温离心10分钟。
        ? 取上清分装冻存。


        注意事项
        ? 尽量取出样本后2小时处理保存
        ? 建议加入蛋白酶抑制剂 (PMSF) (Sigma) ,EDTA (Sigma Diagnostics)


        7. 灌洗液样本处理
        ? 灌洗样本采集一般采用无菌生理盐水、PBS、Hank’s液作为灌洗的buffer。
        ? 使用注射器吸取上述灌洗液在灌洗的器官上反复冲洗3-5次,灌洗液的体积可以根据具体情况进行调整,例如:大鼠可以每次5ml重复注入-回抽操作3次,15ml约可回收9-12ml灌洗液(总回收率60-75%)。
        ? 如收集的灌洗液中含有杂质,可以使用离心机1000转/分钟离心10 分钟,收集上清。
        ? 将收集到的灌洗液样本分装后,放入-80°C进行保存。


        8. 关节滑液样本处理
        ? 常规采取关节腔穿剌术抽取关节滑液。
        ? 无菌注射器,抽取膝关节滑液.5ml以上注入EP管中。
        ? 4℃、3000r/min离心10min,取上清液封盖。
        ? 将收集到的关节滑液样本分装后,放入-80°C进行保存


        9. 脑脊液本处理
        ? 侧卧位腰椎穿刺术
        ? 4°C,1500g离心15分钟,收集上清,≤-20°C保存在无菌管中 (建议样本在-20°C保存不超过一个月,如超过一个月,尽可能把 样本保存在-80°C中)。 


        注意事项
        ? 尽量在4冰上及4度环境中处理样本。
        ? 分装冻存,避免反复冻融。
        ? 放弃被血细胞污染的CSF。血液细胞污染的标准为:500个/ul 。
        ? 离心后样本应该立即分装冻存,间隔时间不超过2h


        10. 裂解液样本处理 蛋白裂解液:40-030
        10.1. 样本裂解液收集处理(1-5mg/ml)(悬浮细胞或组织)
        ? 新鲜组织:将组织分离后, PBS清洗3遍,液氮速冻,-80保存,备用
        悬浮细胞:离心收集胞沉,并用PBS清洗3遍,-80保存,备用
        ? 准备细胞或组织,组织样本尽量将所有样本重量统一。
        ? 将组织样本加入液氮进行研磨(细胞样本不需要)。
        ? 加入冰预冷的1×Milliplex MAP 裂解液( Cat.No.43-040,用前加蛋白酶抑制剂),裂解液用量根据不同样本进行调整。
        ? 离心或者滤膜过滤去除杂质碎片,
        滤膜选择建议:
        ? ≥2ml,采用EMD Millipore Catalog#SLPBDZ5NZ
        ? 0.5-2ml,采用EMD Millipore Catalog#UFC0DV25
        ? ≤0.5ml,采用EMD Millipore Catalog#UFC30DV00
        ? 将裂解液进行总蛋白定量,并将浓度调整为1到25μg总蛋白 (25μl 40-1000μg/毫升)。总蛋白量的10μg/孔是比较常 用的浓度。
        ? 收集裂解液加入蛋白酶抑制剂(20-201 Protease Inhibitor Cocktail),-80°C保存。
        注意事项:
        ? 尽量在冰上及4度环境中处理样本
        ? 分装冻存,避免反复冻融。
        10.2.细胞裂解液收集处理:(40ug/ml-1mg/ml)(贴壁细胞)
        ? 预冷PBS(TBS)清洗细胞
        ? 加入裂解液(使用前加蛋白酶抑制剂,建议裂解液用量如下:(150 mm培养皿中加0.6ml裂解液, 0.3 mL per 100 mm培养皿中加0.3ml裂解液, 24孔板每孔加 0.1 mL裂解液).
        ? 刮下细胞并转移至离心管中,4度轻柔震荡10-15分钟。
        ? 通过过滤或者离心方式取上清
        ? 取部分进行蛋白定量
        ? 其余部分分装冻存




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